Veterinar na farmi najviše vremena treba da provede na opservaciji svinja, praćenju znakova poremećaja opšteg zdravstvenog stanja i tek kad ima kompletne podatke o istoriji bolesti može da pristupi odabiru svinja od kojih će se uzeti uzorci, bilo da je reč o uzorcima krvnog seruma, briseva, oralne tečnosti ili odabiru svinja za obdukciju.

Uzimanje uzoraka sa obdukcije

Obdukcija uginulih svinja je od velike važnosti za veterinare na farmi zbog toga što im obezbeđuje potpunije razumevanje i praćenje procesa bolesti, edukaciju, kao i ranu detekciju novih pretnji po zdravlje životinja. „Oči i ruke“ patologa su najbolji početak kvalitetnog istraživanja uzroka uginuća. Nedavno uginule ili na human način eutanazirane životinje, koje su prethodno imale simptome akutne bolesti, uvek imaju prioritet prilikom odabira životinja za obdukciju. Obdukcija predstavlja plansko otvaranje i sistematski pregled leša s ciljem utvrđivanja, proučavanja i objašnjenja patološko-anatomskih promena na osnovu kojih treba doneti zaključak o uzroku smrti ili postojanju bolesti.

Sa obdukcije se prevashodno uzorkuju delovi makroskopski promenjenih organa i korespodentni limfni čvorovi, ali je preporučljivo uzorkovati i druge organe. U nekim slučajevima, za dijagnostiku i uzorkovanje je dovoljan samo jedan organ, kao što su pluća i traheobronhijalni limfni čvorovi kod respiratornih bolesti. Ukoliko obdukciju izvodi veterinar na farmi, neophodno je da podatke sa obdukcije detaljno unese u propratni akt, koji prati uzorke. Prilikom uzimanja uzoraka sa obdukcije, potrebno je voditi računa da se spreči unakrsna kontaminacija, tako što se za uzorkovanje od svake naredne jedinke uzimaju čiste rukavice i pribor, a creva i sadržaj creva se otvaraju i uzorkuju na kraju. Uzorci uzeti sa obdukcije moraju biti jasno obeleženi i upakovani u nepropusnu ambalažu, a za mikrobiološku analizu i sterilnu ambalažu i transportuju se do laboratorije u hladnom lancu, na temperaturi frižidera.

Slika 1. Oprema za obdukciju.

Materijal koji se šalje na suvim brisevima je podložan isušivanju čime se tokom perioda transporta eliminišu mikroorganizmi osetljivi na desikaciju (na primer rod Streptococcus). Takođe, ni sama količina uzorka na brisu nije dovoljna naročito ako je potrebno inokulisati više različitih podloga. Zbog toga, brisevi ne predstavljaju idealan način uzorkovanja za mikrobiološka ispitivanja te ih treba izbegavati. Izuzetak predstavljaju komercijalno dostupni brisevi sa transportnom podlogom (slika 3), pomoću kojih se održava vijabilnost uzročnika. Kad god je to moguće, uzorak za mikrobiološka ispitivanja treba da sadrži komad tkiva veličine oko 2–5 cm (min. 4 cm3). Organi grudne šupljine, parenhimatozni organi trbušne šupljine kao i creva i njihov sadržaj se obavezno uzorkuju, pakuju i obeležavaju odvojeno (slika 4). Tečni uzorci (mleko, urin, punktat) pakuju se u sterilne posude (slika 5) u zapremini od oko 2–5 ml. Ukoliko se uzorkuju gnojne promene, pored samog gnojnog sadržaja mora se uzorkovati i kapsula apscesa zbog toga što sam gnoj gotovo nikad ne sadrži vijabilne mikroorganizme.

Vrsta i poreklo uzorka moraju biti adekvatni sa apekta vrste ispitivanja i vrste mikroorganizma čija se izolacija očekuje. Tako, na primer, bakterija Haemophylus parasuis brzo propada na višim temperaturama, pa je veoma bitno da se uzorkovanje kod suspektnih slučajeva izvrši neposredno po uginuću životinje i da se uzorci u što kraćem roku i u hladnom lancu transportuju do dijagnostičke laboratorije. Drugi aspekt je lokalizacija na kojoj infektivni agens ispoljava svoje patogeno dejstvo. Dobar primer je bakterija Brachyspira hyodysenteriae koja se lokalizuje u debelim crevima, pa je uzorak izbora za dijagnostiku ove bakterije debelo crevo ili feces. Ukoliko se uzorkuju delovi tankih creva, ovaj agens neće biti otkriven. U slučaju bilo kakvih nedoumica u vezi sa ovim, najbolje je odmah kontaktirati laboratoriju.

Ako životinje ispoljavaju tipične simptome respiratornih oboljenja, sa aspekta mikrobiologije je izuzetno važno da li će se u laboratoriju poslati bris nosne/ždrelne šupljine, respiratornih puteva ili lezije na plućima. Broj i vrsta potencijalnih patogena se ekstremno razlikuju u zavisnosti od mesta uzorkovanja. Ukoliko se prilikom uzorkovanja posumnja na neki određeni mikroorgarnizam to mora da se navede u propratnom aktu, kako bi laboratorija mogla da primeni odgovarajući metod kultivacije (na primer anaeroban rast klostridija ili specijalne podloge za rast Actinobacillus i Haemophylus vrsta).

Tkiva, telesne tečnosti i brisevi namenjeni mikrobiološkom ispitivanju treba da se transportuju u hladnom lancu, na temperaturi frižidera i da se dostave u laboratoriju što pre, a najkasnije 24 sata od momenta uzorkovanja.

Slika 3. Brisevi za uzorkovanje.

Slika 4. Uzorci za mikrobiološka ispitivanja.

Molekularne metode ispitivanja imaju nekoliko značajnih prednosti u odnosu na klasične metode mikrobiološke dijagnostike. Neke od prednosti ove tehnologije su brzina dobijanja rezultata, specifičnost, detekcija patogena koji se teško kultivišu, manje rizična detekcija opasnih patogena, olakšana i preciznija tipizacija mikroorganizama. Pored toga, integritet nukleinskih kiselina je mnogo bolje očuvan tokom određenog vremenskog perioda nego vijabilnost tih istih mikroorganizama, zatim nukleinske kiseline mikroorganizama perzistiraju u organizmu životinje i nakon inicijalnog tretmana čime je njihovo dokazivanje omogućeno iako kulturelno više nije. Na kraju, molekularne metode odlikuje visoka osetljivost, što znači da mogu da se izvedu sa znatno manjom količinom uzorka i uz primenu manje invazivnih tehnika uzorkovanja. Upravo visoka senzitivnost predstavlja jedan od glavnih problema prilikom uzimanja uzoraka za ovu vrstu ispitivanja. Naime, molekularnim metodama moguće je dokazati prisustvo tek nekoliko ciljnih DNK/RNK fragmenata (manje od 10), što znači da se posebno mora voditi računa o kontaminaciji (strogo menjanje rukavica i pribora za uzorkovanje, pakovanje u nepropusnu ambalažu koja može da se zatvori i sl.).

Kao uzorci za molekularna ispitivanja mogu da posluže različite vrste briseva, koža, tkiva, kosti, krv, semena tečnost, mleko, plјuvačka, feces ili bilo koji drugi materijal koji sadrži nukleinske kiseline. Najčešći uzorci za detekciju većine uzročnika zaraznih bolesti svinja su krv, tkiva i brisevi. Za PCR analize se uzorkuje oko 2 ml krvi u vakutajnere sa dodatkom EDTA (ljubičasti čep; slika 7). Za uzorkovanje tkiva i telesnih tečnosti mogu se koristiti i kartice sa filter papirom (FTATM Classic Card, Insta DNATM Cards; slika 8), koje su specijalno dizajnirane za čuvanje i transport uzoraka za molekularna ispitivanja. Uzorci koji će se testirati u pulu, treba da se uzorkuju individualno i da se jasno obeleže. Uzorci za molekularna ispitivanja se pakuju u plastične kese ili posude koje mogu čvrsto da se zatvore i na temperaturi frižidera se transportuju do laboratorije.

Slika 7. Vakutajner za uzorkovanje pune krvi sa EDTA antikoagulansom.

Grubo rukovanje sa uzorkom, smrzavanje i pregrevanje uzorka ili nepotpuno odvajanje eritrocita od seruma može dovesti do hemolize, koja u zavisnosti od stepena, može imati negativan uticaj na rezultate pojedinih seroloških testova.

Moderne tehnike uzorkovanja

Tradicionalne metode dijagnostike bolesti na farmi zahtevaju uzorkovanje krvi ili različitih tkiva, što je stresno za životinje i zahteva određene veštine, vreme i troškove. Modernije metode uzorkovanja, kao što su uzorkovanje oralne tečnosti i procesne tečnosti, omogućavaju detekciju nekoliko važnih bolesti, bilo na individualnom nivou ili na nivou zapata. Obe metode uzorkovanja su pogodne za detekciju bolesti u ranoj fazi, zahtevaju relativno malo vremena i nisu ili su minimalno stresne za životinje.

Oralna tečnost je mešavina pljuvačke i transudata oralne sluznice, a dobija se ceđenjem pamučne užadi, koje su svinje prethodno žvakale (slika 11). Oralna tečnost se uzorkuje od svinja starijih od 21 dana. Uže se postavlja tako što se veže za ogradu boksa, u visini ramena svinja i to najbolje rano ujutro nakon buđenja, a pre hranjenja. Kada se prvi put uzorkuje, obično je potrebno i do 60 minuta, a kasnije se svinje brzo naviknu i uzorkovanje traje 20–30 minuta. Rezultati istraživanja ukazuju da uzorak oralne tečnosti dobijen iz jednog užeta, postavljenog u boks u kom se nalazi oko 25 svinja, u trajanju od 30 minuta, reprezentuje status od oko 80 procenata životinja smeštenih u taj boks. Uže se može odmah iscediti u bocu sa poklopcem ili se pakuje u nepropusnu PVC kesu, jasno obeleži i u hladnom lancu transportuje do dijagnostičke laboratorije.

Iz oralne tečnosti mogu se detektovati antitela protiv: Afričke kuge svinja (AKS), klasične kuge svinja (KKS), reproduktivno respiratornog sindroma svinja (PRRS), cirkovirusa svinja tipa 2 (PCV2), virusa influence tipa A i nekih drugih uzročnika. Pored toga, iz oralne tečnosti se mogu detektovati i specifični delovi genoma: AKS, KKS, PRRS, PCV2, virusa influence tipa A, virusa Aujeckijeve bolesti svinja, cirkovirusa svinja tipa 3 (PCV3), virusa epidemične dijareje svinja (PEDV), virusa transmisivnog gastroenteritisa svinja (TGEV), delta korona virusa svinja (PDCoV), parvovirusa svinja (PPV), rotavirusa svinja, Mycoplasma hyopneumoniae i drugih. Lista uzročnika oboljenja, čija je detekcija iz oralne tečnosti svinja potvrđena se stalno proširuje.

Umesto da se odbace, testisi i repovi dobijeni kastracijom i sečenjem repova prasadi se pakuju u nepropusne plastične kese, koje se obeležavaju i u hladnom lancu transportuju do laboratorije. U laboratoriji se iz ovih uzoraka filtracijom dobija procesna tečnost. Uobičajeno je da jedan uzorak predstavljaju testisi i repovi od 5–6 legala prasadi. Ovaj uzorak je veoma dragocen jer nam omogućava detekciju bolesti u ranoj fazi u prasilištu (slika 12). Iz procesne tečnosti, primenom molekularnih metoda, mogu se detektovati specifični delovi genoma PRRS, PCV2, PCV3, PEDV, Mycoplasma hyopneumoniae i drugih.

Obeležavanje i pakovanje uzoraka

Svaka laboratorija treba da ima definisan propratni akt, koji je potrebno što detaljnije popuniti, a koji sadrži podatke o naručiocu ispitivanja, vlasniku, vrsti, rasi, polu, starosti, obeležju životinje, kliničkim siptomima, makroskopskim lezijama, prethodnom tretmanu, vakcinaciji, morbiditetu i mortalitetu u grupi životinja, uzetim uzorcima i traženim testovima. Ukoliko je suspektna zoonozna bolest, to mora jasno da se naznači. Propratni akt se pakuje u kesu koja ne propušta vodu i transportuje zajedno sa uzorkom.

Osnovni princip pakovanja uzoraka je da se koristi trostruka ambalaža. Primarna ambalaža može da bude kesa (slika 6), epruveta ili druga plastična posuda (slika 5), koje mogu da se zatvore. Špricevi, rukavice i kese bez mogućnosti zatvaranja nisu pogodna ambalaža za transport. Tečni uzorci se pakuju u posude sa poklopcem. Posude sa uzorcima moraju biti jasno obeležene i za to se koriste vodootporni flomasteri.

Ovako zatvorena i obeležena primarna ambalaža se zatim zatvara u sekundarnu ambalažu (nepropusna kesa) koja sadrži adsorbentni materijal (papirna vata). Sekundarna ambalaža se zatim pakuje u transportni kontejner–tercijarna ambalaža, a obično je to ručni frižider. Ova ambalaža treba da sadrži rashladno sredstvo i materijal koji treba da zaštiti uzorke (stiropor ili slično). Sredstva za rashlađivanje ne treba da budu u direktnom kontaktu sa uzorcima već se pakuju u nepropusne kese.

Kontinuirani rast i razvoj svinjarske proizvodnje, kao i uvođenje sofisticirane tehnologije na farmama svinja predstavljaju sve veći izazov za veterinara na farmi, od koga se očekuje veći nivo znanja i ekspertize. Da bi se odgovorilo na ove izazove i da bi se uspostavila efikasna kontrola zdravstvenog stanja svinja, značajna je uloga veterinarske dijagnostičke laboratorije. Kako bi bili odabrani odgovarajući uzorci i testovi i kako bi rezultati laboratorijskog ispitivanja bili pravilno interpretirani i upotrebljeni, od ključnog značaja je dobra komunikacija između veterinara na farmi i veterinarske dijagnostičke laboratorije.