Udruženje vetrinara praktičara Srbije - UVPS
Mogućnosti primene asistiranih reproduktivnih tehnologija u razvoju posebno interesantnih rasa ovaca u Republici Srbiji
Autori:
Aleksandar Milovanović - Naučni institut za veterinarstvo „Novi Sad“, Novi Sad, e-mail: aca@niv.ns.ac.rs;
Nevena Maksimović - Institut za stočarstvo, Zemun-Beograd;
Tomislav Barna - Naučni institut za veterinarstvo „Novi Sad“, Novi Sad;
Jelena Apić - Naučni institut za veterinarstvo „Novi Sad“, Novi Sad;
Miodrag Lazarević - Fakultet veterinarske medicine, Univerzitet u Beogradu, Beograd;
Miloš Trajković - Trajko-vet DOO, Čačak
Kratak sadržaj: U cilju postizanja intenzivnijeg i ekonomičnijeg razvoja ovčarstva neophodne su primene različitih asistiranih tehnologija reprodukcije (engl. Assisted Reproductive Technologies – ART). Selektivno oplemenjivanje „prirodnim putem“ zahteva dosta vremena, dok ART metode, kao što su: veštačka oplodnja, indukcija i sinhronizacija estrusa, multipla ovulacija i embriotransfer (MOET), in vitro oplodnja, seksiranje semena i embriona, pa sve do transgeneze i kloniranja, povećavaju stope genetskog progresa i dobijanje većeg broja potomaka od genetski superiornih životinja. Generacijski interval se značajno može umanjiti kombinovanjem postupka veštačke oplodnje kao jedne od najstarijih i najčešće korišćenih ART, sa novijim tehnikama, kao što su sinhronizacija estrusa, superovulacija, in vitro proizvodnja i prenos embriona. Seksiranje semena ovnova više nije novost kao ni određivanje pola embriona. Transgenezom je moguće promeniti genome potomstva u smislu funkcionalnog brisanja ili dodavanja specifičnih gena.
Specijalizovane rase ovaca, kao što su visoko-plodne (britanska mlečna ovca, romanovska, rido), plodno-tovne (teksel-borola), izrazito tovne (teksel-belteks, safolk, šarole), kombinovane (Il de Frans) i posebno dorper rasa ovaca, kao i izrazito mlečne ovce (asaf, lakon) mogu i moraju postati prioritetne rase koje obezbeđuju profitabilnu proizvodnju. Ove rase, primenom progresivnih reproduktivnih tehnika u perspektivi mogu u potpunosti promeniti efikasnost ovčarske proizvodnje i razvoj ruralnih područja. Na žalost, politika odnosa „sivih eminencija“ prema programima ovakvog razvoja je negativna i smisleno, udruženo deluje sa dobro organizovanom klaničnom industrijom na daljem srozavanju ovčarstva.
Ključne reči: ART, ovce, Republika Srbija
Uvod
U modernom ovčarstvu, pomoćne reproduktivne tehnologije se uglavnom koriste za vansezonsku indukciju estrusa, poboljšanje reproduktivnih odlika (broja jaganjaca) i genetsko poboljšanje. Pored toga, one mogu dati značajan doprinos očuvanju ugroženih rasa, kao i u programima eradikacije različitih bolesti. Dok su njihove aplikacije znatno zastupljenije kod krava, kod ovaca (generalno kod malih preživara), su gotovo ograničene na veštačko osemenjavanje, izuzimajući napredne zemlje gde se i dalje oblikuju potrebe savremenog ovčarstva (prelaz sa ovaca bogatih runom na mesnate koje odbacuju vunu, kao i nagli skok broja ovaca muznih rasa). Primeri su: Novi Zeland, Australija, Kina, Rusija, Brazil i Francuska.
Glavna ograničenja šire primene ART kod malih preživara su: postojanje anestrusnog perioda, različit odgovor na superovulaciju, izostanak oplodnje jajnih ćelija, velika i skupa početna ulaganja i potreba za hirurškim zahvatom za prikupljanje i transfer gameta. Bez obzira na to, u posljednjih 30 godina je ostvaren značajan napredak u embriotehnologiji kod ovaca, pogotovo u izazivanju superovulacije i proizvodnji embriona u in vitro uslovima.
Pomoćne tehnologije u reprodukciji (ART) su intervencije koje obuhvataju postupke biotehnologije pod kontrolisanim uslovima koji se koriste u uzgoju životinja i utiču proširenjem poželjnih genetskih osobina prema odabranim – željenim proizvodnim osobinama. ART se zasniva na određenim metodama, kao što su: veštačka oplodnja, indukcija i sinhronizacija estrusa, višestruka ovulacija i prenos embriona (MOET), in vitro oplodnja, seksiranje spermatozoida i embriona, transgeneza, kloniranje i drugi postupci. Aplikacija ART omogućava povećanje stope genetskog progresa i stvara mogućnost za modifikaciju bioloških procesa u cilju donošenja promena koje inače ne bi mogle da se dese prirodno. Njima se takođe omogućava da jedinke superiorne genetske moći proizvedu mnogo više potomaka nego što bi to bilo moguće kroz prirodni tok reprodukcije, kao i da se dobije potomstvo od neplodnih ili subfertilnih jedinki koje su genetski vredne. Značajna prednost ART se takođe odražava u organizaciji proizvodnih kapaciteta na način koji omogućava dobijanje potomstva i mleka van prirodne sezone, što je za ovčarsku proizvodnju od velikog značaja. Zanimljivo je napomenuti da su tehnike proizvodnje i manipulacije embrionima kod preživara, počevši od osemenjavanja do kloniranja, razvijene upravo na ovcama a zatim prenete na goveda, kao ekonomski značajniju vrstu.
Veštačko osemenjavanje (VO)
Veštačko osemenjavanje je bio prvi i prelomni biotehnološki postupak koji je doprineo poboljšanju reprodukcije i genetske osnove mnogih domaćih životinja. Opšte prihvatanje tehnike veštačke oplodnje dalo je podsticaj razvoju drugih biotehnoloških metoda, kao što su duboko zamrzavanje semena, seksiranje semena i in vitro oplodnja. Postoje četiri tehnike veštačke oplodnje: vaginalna, cervikalna, transcervikalna i direktna intrauterina i tri metode čuvanja semena: sveže, rashlađeno i zamrznuto.
Za vaginalni i cervikalni postupak osemenjavanja se preporučuje korišćenje sveže sperme i visokih doza spermatozoida, dok upotreba zamrznutog semena dovodi do neprihvatljivo niske stope koncepcije od 10 do 30 procenata, kako navodi veći broj autora. Proces dubokog zamrzavanja spermatozoida značajno smanjuje njihovu pokretljivost i stoga se dešava da samo mali broj spermatozoida može premostiti put od vagine do mesta oplodnje (jajovoda). Izuzetak su studije norveških autora u kojima je vaginalna inseminacija ovaca sa odmrznutom dozom semena u koncentraciji od 200 × 106 spermatozoida dovodila do jagnjenja kod 57–67,4 procenata ovaca. Što je još interesantnije, ova osemenjavanja sprovode obučeni farmeri, „na slepo“, uvođenjem pistoleta u vaginu po dorzalnom zidu sve do fundusa, gde istiskuju seme, bez upotrebe spekuluma. Norveška metoda pripreme semena i razređivača je veoma specifična. Ekvilibracija semena se odigrava sa nižim koncentacijama spermatozoida, u mlečno-žumanjčanom razređivaču bez glicerola, nakon čega sledi centrifugiranje-koncentrovanje semena, neposredno pre zamrzavanja. Seme se pakuje u pajete zapremine od 0,5 ml. Omasovljenje postupka osemenjavanja ovaca je nastalo kao posledica nacionalnog programa iskorenjivanja bolesti maedi visna koja se upravo širila razmenom ovnova. Treba napomenuti da se osemenjavanje sprovodi nakon prirodne detekcije estrusa ovnovima probačima. Jedino u Norveškoj, uspešnost vaginalnog osemenjavanja zamrznutim semenom kao i masovnost odziva farmera, dobija punu praktičnu i ekonomičnu primenu, uz zootehničke, sanitarne i selekcijske uspehe.
Primer uspešne primene tehnike LVO (od „epruvete do trpeze“)
Transcervikalni metod daje mogućnost korišćenja zamrznutog semena, ali je usled postojanja anatomske barijere (slabe prohodnosti cerviksa pomoću pistoleta i deponovanja semena u matericu) vrlo retko primenjivan u ogledima, a u praksi gotovo nebitan. Postoje radovi u kojima se navodi da je upotrebom oksitocina, kao miorelaksansa cerviksa, depozicija semena u matericu postignuta kod 77 do, čak 100 procenata ovaca (u poređenju sa 0 i 20 procenata bez upotrebe oksitocina). Međutim, pojedini autori navode da egzogena aplikacija oksitocina dovodi do umanjenja uspeha koncepcije i isključuju oksitocin kao moguće rešenje. Blokada cerviksa predstavlja problem i za program transfera embriona.
Metoda koja je unela revoluciju u oblasti biotehnologije osemenjavanja ovaca je laparoskopsko veštačko osemenjavanje ovaca (LVO). Veštačko osemenjavanje ovaca je dugo smatrano nepraktičnim zbog teškoća u otkrivanju estrusa i kontroli polnog ciklusa, kao i zbog teškoća u zamrzavanju semena ovna. Kada su ovi problemi otklonjeni, uspešnost osemenjavanja (pogotovo zamrznutim semenom) i dalje je ostala niska jer se kod ovaca seme ne može deponovati kroz otvor grlića. Za razliku od grlića krava i koza, grlić ovce je čvrsta prepreka za prolaz instrumenata za transcervikalno intrauterino osemenjavanje, ne samo zbog fizičke veličine i uskog prečnika cervikalnog kanala (čak i u estrusu), već i zbog oborenih materičnih usta (kljunasti portio vaginalis uteri), koji često zatvara otvor na cerviksu, te je, praktično, cerviks neprolazan za instrumente.
Australijski istraživači, Killeen i Caffery, su još 1982. godine uveli postupak osemenjavanja ovaca pomoću laparoskopa. Laparoskopijom je preko trbušnog zida, uz minimalni hirurški rez, omogućeno i veštačko osemenjavanje ovaca i embriotransfer (ET), direktno u matericu. Međutim, za tu proceduru su neophodni skupa oprema i dobro obučen tim. Ova tehnika se u R. Srbiji primenjuje tek od 2012. godine. Njene prednosti su u: visokoj uspešnosti osemenjavanja i zamrznutim i svežim semenom (50–85 procenata; slično prirodnom parenju); upotreba vrlo male količine semena, tako da se jedan ejakulat može višestruko razrediti (do 150 doza); od jednog ovna se u toku godine može osemeniti više hiljada ovaca (do 20 000); za vrlo kratko vreme se drastično povećava broj jagnjadi koja vode poreklo od vrhunskih ovnova; seme se može lako primenjivati/transportovati od farme do farme, rizik prenošenja zaraznih bolesti je isključen; zamrznuto seme je garancija očuvanja grla u slučaju uginuća, nemogućnosti kretanja ili neplodnosti; ovnovi su proverenog zdravstvenog i priplodnog kvaliteta pre puštanja u eksploataciju; veliki broj ovaca se može osemeniti u toku jednog dana (i do 350); ovce se jagnje u vrlo kratkom vremenskom periodu, što omogućava bolju organizaciju posla na farmi i omogućeno je držanje manjeg broja ovnova. U suštini je najbitnije širenje superiornih gena plodnosti, mlečnosti i tovnosti na široku populaciju jedinki.
Prednost LVO leži u mogućnosti uspešne upotrebe zamrznutog semena sa malim dozama i niskim koncentracijama sperme, obično sa 40 do 80 miliona spermatozoida po dozi. Poređenja radi, Buckrell (2000) ističe sledeće rezultate za koncepciju ovaca u zavisnosti od primenjenih tehnika inseminacije kada se koristi zamrznuto seme: vaginalno 10–20, cervikalno 25, transcervikalno 40–70 (uz uspešan prolaz cerviksa instrumentima) i korišćenjem intra uterine laparoskopije 50–80 procenata.
Opisani su i postupci ispiranja embriona laparoskopskom tehnikom, ali je procenat dobijenih embriona manji za 10–20 procenata u odnosu na hiruški pristup (laparotomija). Međutim, laparoskopija nalazi svoju upotrebnu vrednost u tehnikama „ovum-pick up“ (OPU) koja polako preuzima primat. Prednost je u manjoj upotrebi hormona (pa i bez upotrebe), brojnijoj proizvodnji embriona uz minimalni operativni zahvat, ali i potrebom za intenzivnijim i složenijim radom.
Seksiranje semena ovnova više nije novost i u svetu se pojavljuju komercijalni repro – centri koji koriste mogućnost uslužnog iznajmljivanja protočne citometrije za seksiranje semena ovna (Australija, Engleska, Rusija i Južna A frika). Već i doze od svega 1 milion pokretnih spermatozoida mogu, laparoskopskom tehnikom, da obezbede koncepciju od 65 procenata i to je svakako put za znatno povećanje stada.
Hormonska sinhronizacija i indukcija estrusa
Sinhronizacija i indukcija estrusa kod ovaca je metoda kojom se hormonskim ubrizgavanjem istovremeno ostvaruje seksualna želja (gonjenje) i oplodnja svih ili većine ovaca u stadu. To je osnova za primenu procedura vansezonskog pripusta, veštačke oplodnje, prenošenja embriona i „ovum pick up“ procedure, naročito tokom anestrične sezone.
Postupak sinhronizacije, upotrebom progesterona, je najzastupljeniji kod ovaca i uključuje upotrebu progestina, sintetičkih progesteronskih analoga koji se mogu aplikovati putem vaginalnih sunđera – pesarija natopljenih fluorogestanom i medroksiprogesteron acetatom, subkutanim implantatima (Synchropart, Veramix, Norgestomet, Sinhromat-B), dodavanjem melengestrol acetata oralnim putem u hrani i intravaginalnim CIDR silikonskim implantatima (metoda kontrolisanog intravaginalnog otpuštanja leka). Progesteron se obično daje u kombinaciji sa serumom ždrebnih kobila (SŽK) i može se aplikovati dan-dva pre ili na sam dan vađenja implantata (egzogenog izvora progesterona). Doza SŽK se određuje u zavisnosti od toga da li se tretman obavlja tokom prirodne sezone parenja ili anestričnog perioda, starosti i ocene telesne kondicije ili da li je cilj da se izazove superovulacija, radi povećanja broja jaganjaca po ovci (od 400–700 IJ).
Drugi pristup sinhronizacije estrusa se zasniva na upotrebi prostaglandina F2α i njegovih analoga, koji deluju tako što izazivaju regresiju žutog tela. Uobičajena procedura u korišćenju ove metode je da se injekcija PGF2α daje dva puta, sa razmakom od 9 do 11 dana, zbog toga što žuto telo reaguje na dejstvo prostaglandina između 5. i 14. dana ciklusa. Ova procedura je pogodna za sinhronizaciju estrusa i ovulacije tokom prirodne sezone, kada ženke cikliraju, sa formiranjem žutog tela. Tokom anestričnog perioda, upotreba PGF2α daje dobre rezultate u kombinaciji sa progesteronom ili GnRH.
Usled sve većeg pritiska ekoloških predstavnika, sinhronizacija melatoninom, smanjenjem koncentracije progesterona u pesarijama kao i efekti skraćivanja dana (zamračivanje prostorija i veštačka kontrola osvetljenja u zatvorenim sistemima uzgoja) postaju moguća alterantiva tradicionalnim metodama sinhronizacije.
Laboratorije za seksiranje senena ovnova i bikova se iznajmljuju zainteresovanim kompanijama (foto pristigao jubaznošću Escobar Juniora, ST Genetics, USA)
MOET – Višestruka ovulacija i prenos embriona (Multiple ovulation and embryo transfer)
Presađivanje embriona (ET) je metoda asistirane reprodukcije koja se zasniva na prenosu embriona iz životinje donora u životinju primaoca, pri čemu su pojedini donori uvek visokokvalitetne životinje superiorne genetske osnove, a primaoci (recipijenti) su životinje niže uzgojne vrednosti. Recipijent dovršava bremenitost i jagnji potomke visoke genetske vrednosti. Donor se vraća u normalni polni ciklus gde se može prirodno spariti ili ponovno uključiti u program ET za 6 nedelja. Zahvaljujući ET, povećava se broj potomaka koje jedna visokovredna ovca može u toku svog života da proizvede. Jednim ispiranjem se može prikupiti čak i do 15 embriona, mada se broj dobijenih embriona uglavnom kreće od 5 do 10. Na ovaj način, jedna ovca u toku jedne godine može dati preko 30 potomaka. Ova tehnika je u Australiji, Južnoj Africi i Brazilu dovedena do rutinske, terenske metode, gde samo jedan veterinar u toku 5 radnih dana postiže i do 1 000 proizvedenih i prenetih embriona.
Zahvaljujući napretku tehnike, laparoskopsko prikupljanje embriona je danas efikasna i minimalno invazivna tehnika, koja omogućava višekratnu kontinuiranu proizvodnju embriona od istog davaoca. U tu svrhu se mogu koristiti i grla koja bi se isključila iz reprodukcije zbog drugih razloga kao što su upale vimena, hromost ili starost.
Embriotransferom se kod ovaca poboljšava genetski potencijal stada, omogućava uvećanje genetski bitnih majčinskih linija kao i grla genetski otpornih na skrepi i omogućava očuvanje vrednog i retkog genetskog materijala. Embrioni su prioritetan metod uvoza grla jer je rizik po unos bolesti znatno manji ukoliko potiču od testiranih grla i isprani su prema međunarodnim standardima tako da se mogu koristiti za iskorenjivanje bolesti unutar stada.
Rezultati programa embriotransfera znatno variraju, od potpuno neuspešnih do veoma uspešnih, čak i preko svih očekivanja. Uspeh indukcije superovulacije, sinhronizacije estrusa donora i primaoca, kao i sposobnost postizanja optimalne oplodnje su tri glavna faktora odgovorna za uspeh transplantacije embriona. Smatra se da 10–25 procenata donora ne reaguje na protokol superovulacije, pa sve do slučaja malog broja oplođenih jajnih ćelija. Nepoželjni efekti koji se javljaju kod indukcije superovulacije, kao što su neovulirani folikuli, niska stopa oplodnje i mali broj dobijenih embriona, iako su praktično dobro poznati, nisu u potpunosti proučeni. Smatra se da se javljaju zbog hormonske neravnoteže u telu donora i posebno su evidentni u ponovljenim procedurama superovulacije. Često se u literaturi, kao uzrok neuspeha indukcije superovulacije, navodi primena PMSG, koji, zbog visoke molekulske težine, ima dug poluživot (21 sat) i indukuje produžene – preduge uslove za rast folikula, formiranje anovulatornih folikula i preranu luteinizaciju folikula. Da bi se rešio ovaj problem, preporučuju se brojne strategije, kao što su: primena anti-PMSG antitela, upotreba FSH umesto PMSG, uvođenje GnRH (gonadotropnog oslobađajućeg hormona) ili hormona rasta. U slučaju da recipijenti nisu dobro sinhronizovani, transplantirani embrioni umiru i gravidnost se ne može uspostaviti usled izostanka podrške materice, žutog tela i progesterona. Varijacije u sinhronizaciji estrusa donora i recipijenta ne bi trebale da budu veće od ±12 sati.
Nivo hormona u krvi donora je veoma poremećen velikim brojem folikula aktiviranih hormonima, radi indukcije superovacije. Ovi hormoni modifikuju signale normalnog estrusa i mogu imati negativan uticaj na transport spermatozoida kroz grlić do mesta oplodnje. Postoji jaka veza između uspešne superovulacije i neuspešne oplodnje, tako da donori koji uspešno proizvode veliki broj ovuliranih oocita često imaju manje oplođenih jajnih ćelija. Ovo se može prevazići upotrebom laparoskopske tehnike osemenjavanja, koja se smatra posebno efikasnom kod jedinki sa velikim brojem ovuliranih jajnih ćelija.
Laparoskopsko prukupljanje jajnih ćelija (Laparoscopic ovum pick-up-LOPU) i in vitro proizvodnja embriona
Poslednjih godina raste interesovanje za metode in vitro proizvodnje embriona kod svih vrsta farmskih životinja. Metoda in vitro proizvodnje embriona za transplantaciju podrazumeva sakupljanje oocita, in vitro sazrevanje oocita, in vitro oplodnju i in vitro razvoj nastalih embriona. Kod ovaca se sakupljanje oocita uglavnom vrši laparoskopskom tehnikom. Laparoskopska kolekcija oocita je efikasna i minimalno invazivna tehnika koja daje mogućnost ponovnog korišćenja ovaca i ponovnu proizvodnju embriona od strane jednog donora na nedeljnom nivou. in vitro sazrevanje/maturacija i oplodnja/fertilizacija (IVM/IVF) pružaju mogućnost prevazilaženja nekih problema koji se odnose na klasičan MOET postupak. U te probleme spadaju: slaba stopa ovulacije, rana regresija žutog tela i loša oplodnja. Problem pojedinačnih varijacija u odgovoru na tretman gonadotropinima ostaje još uvek aktuelan, ali LOPU metoda skoro uvek daje veći broj prikupljenih oocita po donoru. Osim toga, IVM/IVF omogućava dobijanje potomaka životinja koje se ne mogu reprodukovati pomoću V.O. i MOET, kao što su polno nezrele, veoma mlade životinje. Takođe se omogućuje čuvanje i korišćenje oocita izuzetno vrednih životinja koje više ne žive ili čiji je opstanak ugrožen, što je značajno za programe zaštite genetskih resursa.
Razvoj tehnika za in vitro proizvodnju embriona je doveo do razvoja reproduktivnih biotehnologija sledeće generacije, uključujući intracitoplazmatsku injekciju sperme, proizvodnju transgenih životinja i kloniranje. Sa intracitoplazatskim injektiranjem spermatozoida potrebna je samo jedna ćelija – spermatozoid za oplođenje jajne ćelije, a pokretljivost sperme nije neophodna za uspešnu oplodnju. Međutim, uprkos napretku koji je napravljen u ovoj oblasti poslednjih godina, varijabilnost broja i kvaliteta sakupljenih oocita i niska održivost zamrznutih i odmrznutih embriona proizvedenih in vitro, ograničavaju i dalje široku upotrebu ove, generalno obećavajuće tehnologije.
Posebno interesantne ovce na dohvatu ruke savremenim reproduktivnim tehnikama
Transgeneza i kloniranje
Transgeneza je postupak koji uključuje mikromanipulaciju životinjskim genomom u smislu unošenja stranih DNK sekvenci ili modifikacije postojećih gena. Na taj način je moguće dobiti jedinke sa genomima koje oni prirodno ne poseduju, ali koje će moći da prenesu svojim svojim potomcima. Reproduktivno kloniranje je proizvodnja potomaka „cepanjem“ embriona ili presađivanjem jedra. Razdvajanje-cepanje embriona se javlja prirodno ili može biti indukovano veštački, da bi se formirale dve ili više genetski identičnih jedinki. Presađivanje jedra se može koristiti za „kopiranje“ odabranih životinja za poboljšanje zapata. Ova tehnologija ima još snažnije biotehnološke implikacije kada je u pitanju genetska modifikacija radi poboljšanja proizvodnih osobina, proizvodnje proteina koji su od biomedicinskog interesa, transplantacije organa, proučavanja bolesti ljudi, načina prenosa i proučavanja ekspresije gena.
Do danas je najčešće korišćena tehnika transgeneze koja se izvodi postupkom mikroinjektiranja gena u pronuklearni zigot (in vitro). Međutim, ova procedura nije dala očekivane rezultate kod životinja zbog toga što je praćena niskom stopom integracije strane DNK u genom domaćina i lošeg preživljavanja embriona. Efikasnost proizvodnje transgenskih životinja mikroinženjeringom je kod životinja manja od 1 procenat. Veruje se da je to zbog činjenice da su neke replikacije stranih gena slučajno integrisane u genom domaćina i da remete ekspresiju transgenskih i domaćih gena. Neke nedavne studije su imale zanimljive pozitivne rezultate u proizvodnji transgenih životinja koristeći postupak mikroinjektiranja nakon laparoskopske kolekcije oocita i njihovog sazrevanja i oplodnje in vitro.
U literaturi se spominju i druge alternativne metode koje uključuju: transmisiju DNK posredstvom spermatozoida, intracitoplazmatsko injektiranje (ICSI) transgenskih glava spermatozoida, upotrebu retrovirusnih vektora bilo injekcijom ili infekcijom oocita ili embriona ili upotrebom genetski modifikovanih ćelija donora ovaca, u prenosu nuklearnih ostataka. Reproduktivno kloniranje pomoću nuklearnog transfera se odnosi na stvaranje životinja iz rekonstruisanog embriona proizvedenog prenošenjem jezgra donorske ćelije u oocit iz koga je uklonjen njegov genetski materijal. Prenos jedara iz somatskih ćelija se za sada uspešno koristi kod četiri vrste životinja: krava, ovaca, koza i svinja. Genetska modifikacija, u kombinaciji sa presađivanjem jedra, je veoma moćna tehnologija sa mnogostukom potencijalnom biotehnološkom primenom. Do sada su uspešno proizvedeni klonirani transgeni jaganjci, koji imaju faktor koagulacije za ljudsku krv koji se može izolovati iz mleka i koristiti za lečenje hemofilije, zatim jaganjci u kojima je gen PrP (prion protein), zatim sa humanim genom za antitrombin III, čiji nedostatak kod ljudi dovodi do venske tromboze i plućne embolije.
U toku su istraživanja u kojima se jedra vezivno-tkivnih ćelija, koje imaju veliku moć umnožavanja zamenjuju jedrima jasno selekcionisanih embriona. Na taj način se pravi bezbroj istovetnih kopija ćelija (jedara) koje se zatim, ponovo vraćaju u jajne ćelije nakon enukleacije, praveći identične kopije koje se mogu razviti u istovetne – klonirane brojne jedinke. Ovi tehnike se još razmatraju od strane etičkih komisija i konačno njihovo ozvaničenje je upitno, ali su i teoretski i praktično, one pri kraju.
Geni plodnosti
Najznačajnija prednost jasno lociranog gena za plodnost je da se korišćenjem homozigotnih očeva (ovnova) ova osobina potpuno (100 procenata) prenosi na sve potomke kao trajno obeležje. Svi potomci prve-F1 generacije su heterozigotni i nosioci gena plodnosti, čime se već u prvoj generaciji znatno povećava plodnost do jednog jagnjeta više. Ponovnim osemenjavanjem F1 generacije homozigotnim ovnom dobija se 75 procenata potomaka u homozigotnom obliku a 25 procenata potomaka u heterozigotnom. Genetskom analizom se može stvoriti širok front homozigotnih ovnova koji će se dalje diseminovati kroz stada nisko-produktivnih ovaca i prenostiti gene plodnosti. Time se obezbeđuje dugoročni efekat i prisustvo čvrsto kodirane crte plodnosti u širokoj populaciji ovaca.
Primeri iz stočarski razvijenih zemalja su pravi pokazatelji uspeha smišljenih strategija i praćenja trendova u ovoj oblasti. U Izraelu je, na najmlečnijoj rasi ovaca, assaf, plodnost povećana sa 1,68 na 2,40 (heterozigot) i na 2,55 jaganjaca kod homozigotnih nosioca. U Holandiji, na jednoj od najmesnatijih rasa na svetu (teksel), uvođenjem booroola gena, kod heterozigotnih jedinki je dobijeno 0,6 do 0,9 jaganjaca više, dok homozigoti daju prosečno 1,5 jaganjaca više. Prosečno, u Holandiiji, farmer profitira sa oko 51,40 € po ovci (cene iz 2003. godine), odnosno oko 100 $ više u Izraelu. Štaviše, ovi geni su doprineli dodatnom poboljšanju kvaliteta mesa teksel ovaca koje se smatraju primerom za visok kvalitet, randman i ukus jagnjećeg mesa. Kod ovnova tovne rase lakon ovi efekti su postiguti L alelima (FecL aleli) i broj ovulacija u homozigotnom obliku je oko 4, sa 3 jagnjeta po leglu. Kratkoročni uticaj primene inovativne tehnologije ovog tipa bi podrazumevao prvo i trajno uvođenje gena za plodnost malih preživara na teritoriji R. Srbije.
Time se ostvaruje znatno unapređenje svih proizvodnih rezultata: broja odgajenih jaganjaca, brzine prirasta, količine proizvedenog mleka/mesa i kvalitetnijeg – cenjenijeg proizvoda, bez potrebe da se poveća broj raspoloživih ovaca. Od značaja je i ovladavanje tehnologijom veštačkog osemenjavanja životinja laparoskopskom metodom i njena šira primena, kao i masovnija primena cervikalnog osemenjavanja od strane samih farmera. Obuka za samostalno izvođenje postupka veštačkog osemenjavanja ovaca i koza, od strane odgajivača, pruža mogućnost ispunjenja uslova ekološke proizvodnje i tako izostaje upotreba hormona. Primeri ovakvog rada postoje u Norveškoj i delimično u Rusiji. Ostvaruje se mogućnost uspostavljanja samoodržive proizvodnje na malim gazdinstvima postizanjem tehnološke discipline odgajivača ovaca i koza povećanjem praga znanja i praktične obučenosti. Jasno je da je neophodna i revizija znanja/kontrole tehnopatija kroz stručno i naučno sagledavanje aktuelne problematike određenih regiona na široj populaciji ovaca.
Treba napomenuti da se punom primenom ovakvog pristupa može očekivati dvostruko veća proizvodnja kvalitetnijeg mesa bez potrebe za povećanjem broja priplodnih jedinki na gazdinstvu. Istovremeno, tehnikom laparoskopskog osemenjavanja se disperzija gena plodnosti može ustostručiti, u poređenju sa prirodnim pripustom. Korišćenjem obilja prirodnih resursa, znanja domaće struke kao i najnovijih biotehnološko-genetskih dostignuća u selekciji malih preživara, odgajivači ovaca u R. Srbiji se u potpunosti mogu pridružiti najvišim standardima u tehnologiji proizvodnje visoko-kvalitetnih proizvoda dobijenih od malih preživara koji su deficitarni u zemljama EU i Bliskog istoka.
Na žalost, pokušaji uvođenja navedenih tehnika radi priključivanja ovčarstva razvijenim zemljama kroz konkurse za domaće – nacionalne fondove, nadležnih ministarstava, lokalnih samouprava i nevladinih organizacija su „strasno“ odbijani i ostali su na entuzijazmu nekoliko pojedinaca, što sigurno neće doprineti ozbiljnijem napretku. Ove tehnologije čekaju bolje uslove i razboritije ljude koji odlučuju o tome koji projekti imaju prioritet. Za sada smo samo nemi posmatrači tehnika koje već najmanje 10 godina u razvijenim zemljama ostvaruju svoju punu primenu u genetskom razvoju.
Zaključak
Biotehnološke ART metode nude gotovo neograničene mogućnosti za poboljšanje stočarske proizvodnje. Međutim, do danas, najširu komercijalnu upotrebu u ovčarstvu imaju samo veštačko osemenjavanje i in vivo proizvodnja embriona. Značajna je, sve više, veća dostupnost seksiranog semena, s obzirom da rezultati ukazuju da je samo jedan milion pokretnih spermatozoida u dozi dovoljan za postizanje koncepcije od 65 procenata. Razlozi za još nedovoljno iskorišćen potencijal drugih tehnologija leže delimično u određenim biološkim karakteristikama ovaca kao vrste, ali i u nekim metodološkim ograničenjima. To zajedno doprinosi veoma promenljivim rezultatima koji često ne mogu opravdati visoku cenu pojedinih procedura. Značajne poteškoće proističu iz nemogućnosti izvođenja rutinskih transcervikalnih manipulacija, bilo u inseminaciji ili kolekciji oocita i embriona. Laparoskopija nudi alternativno rešenje ovih problema, ali takođe komplikuje postupke i povećava troškove potrebnih procedura. Osim toga, ona nameće različita pitanja koja se odnose na dobrobit životinja. Nepredvidljivi rezultati u programu superovulacija u ET programima su takođe ograničavajući faktor. Transgeneza i kloniranje su i dalje nedovoljno razvijeni kada je u pitanju njihova šira komercijalna primena, ali i u odnosu na stalne etičke debate. Poboljšanje uslova za široko korišćenje ART u budućnosti, zahtevaće snažne istraživačke napore u cilju poboljšanja našeg znanja o fiziologiji oocita i ranog embriona, ekspresije gena i razvijanju novih i/ili poboljšanju postojećih tehnologija koje će omogućiti praktičniji pristup komercijalnoj upotrebi. Međutim, nove generacije naučnika, unapređeni medijumi, genetski napredak u ovčarstvu, svest o preživarima kao prvoj karici ishrane u različitim geo-klimatskim uslovima otvorili su vrata primeni ovih tehnika u nekoliko ekskluzivnih timova stručnjaka i to ponajviše u Brazilu, Australiji, Engleskoj, Južnoj Africi i Španiji.
Neophodan je jasan strateški pristup u daljem razvoju ovčarske proizvodnje, kroz izgradnju modela uspešnih pokaznih farmi, potpune primene savremenih tehnologija i izbor odgovarajućih (naprednijih) rasa, pogodnih za različite uslove gajenja (visoko intenzivnih do oskudnih, brdsko planinskih i aridnih područja). Ovčije meso ima visoku cenu na stranim tržištima (pogotovo na Bliskom istoku), gde nam je izvoz ograničen samo usled nerešene epizootiološke situacije sa B. ovis, te je moguć izvoz samo kastriranih muških grla. Na tom tržištu, naša jagnjetina je među najskupljim zbog postignutog kvaliteta uvođenjem tovnih rasa. Organizovan otkup od strane udruženja (farmera) bi jedino omogućio da se zasluženi rad realno valorizuje i ono što je uloženo uz profit vrati proizvođačima, koji bi time bili značajno stimulisani da povećaju proizvodnju, a time i za specijalizovane veterinarske usluge i usluge srodnih struka.
Literatura:
1. Ataman MB, Akoz M, Akman O, 2006, Induction of synchronized oestrus in Akkaraman cross-breed ewes during and outside the breeding season: Use of short-term and long-term progesterone treatments, Rev Med Vet, 5, 157, 257–60.
2. Baldassarre H, Karatzas CN, 2004, Advanced assisted reproduction technologies (ART) in goats, Anim Reprod Sci, 82–83, 255–66.
3. Campbell KH, McWhir J, Ritchie WA, Wilmut I, 1996, Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line, Nature, 380, 6569, 64–6.
4. Collares T, Bongalhardo CD, Deschamps CJ, Moreira MLH, 2005, Transgenic animals: the melding of molecular biology and animal production, Anim Reprod, 2, 1, 11–27.
5. Davis HG, 2005, Major genes affecting ovulation rate in sheep, Genet Sel Evol, 37, Suppl. 1, S11–S23 S11, DOI: 10.1051/gse:2004026.
6. Donovan A, Hanrahana PJ, Kummenb E, Duffyc P, Boland PM, 2004, Fertility in the ewe following cervical insemination with fresh or frozen thawed semen at a natural or synchronized oestrus, Anim Rep Sci, 84, 3-4, 359-68.
7. Folch J, Ramon PJ, Cocero JM, Alabart LJ, Beckers FJ, 2001, Exogenous hormone improves the number of transferable embrios in superovulated ewes, Theriogenology, 55, 9, 1777–85.
8. Gootwine E, Reicher S, Rozov A, 2008, Prolificacy and lamb survival at birth in Awassi and Assaf sheep carrying the FecB (Booroola) mutation, Anim Reprod Sci 108, 402–11.
9. Gootwine E, 1995, Increasing prolificacy of the fat tail Awassi sheep using the Booroola FecB gene, In: Gabiña D. (ed.). Strategies for sheep and goat breeding, Zaragoza: CIHEAM, 79–87, (Cahiers Options Méditerranéennes; n. 11), Meeting of the joint FAO/CIHEAM Network on Sheep and Goats, Subnetwork on Animal Resources, 1995/03/26–28, Sidi-Thabet (Tunisia).
10. Grazul-Bilska AT, 2004, Assisted reproductive technology in sheep, Western Dakota Sheep and Beef Day Report, 45, 57–67.
11. Ishwar AK, Memon AM, 1996, Embryo transfer in sheep and goats: a review. Small Ruminant Res, 19, 35–43.
12. Killeen ID, Caffery GJ, 1982, Uterine insemination of ewe with the aid of a laparoscope, Aust Vet J, 35, 256.
13. Kukovics S, Gyökér E, Németh T, Gergátz E, 2011, Artificial Insemination of Sheep – Possibilities, Realities and Techniques at the Farm Level. Artificial Insemination in Farm Animals, Dr. Milad Manafi (Ed.), ISBN: 978-953-307-312-5.
14. Loi P, Ptak G, Dattena M, Ledda S, Naitana S, Cappai P, 1998, Embryo transfer and related technologies in sheep reproduction, Reprod Nutr Dev, 38, 615–28.
15. Milovanović A, Milovanović B, Barna T, Lazarević M, Aleksijević D, 2012, Prvo laparoskopsko osemenjavanje ovaca duboko zamrznutim semenom u Republici Srbiji, Naučni simpozijum „Reprodukcija domaćih životinja i bolesti novorođenčadi“, Divčibare, 4–7. oktobar, Zbornik predavanja, 143–8.
16. Moise L, Moise V, Sonea C, 2012, Management of assisted reproduction in the Palas Merino sheep breed, Anim Sci Biotechnol, 45, 1, 201–5.
17. Paterson L, DeSousa P, Ritchie W, King T, Wilmut I, 2003, Application of reproductive biotechnology in animals: Implications and potentials, Applications of reproductive cloning, Anim Repr Sci, 79, 137–43.
18. Paulenz H, Soderquist L, Adnoy T, Nordstoga AB, Berg KA, 2005, Effect of vaginal and cervical deposition on the fertility of sheep inseminated with frozen-thawed semen, Vet Rec, 156, 12, 372–6.
19. Paulenz H, Adnoy T, Soderquist L, 2007, Comparasion of fertility results after vaginal insemination using different thawing procedures and packages for frozen ram semen, Acta Vet Scand, 49, 26.
20. Perry ACF, Wakayama T, Kishikawa H, Kasai T, Okabe M et al., 1999, Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection, Science, 284, 1180–83.
21. Richardson L, Hanrahan JP, Donovan A, Martí JI, Fair S et al., 2012, Effect of site of deposition on the fertility of sheep inseminated with frozen-thawed semen, Anim Reprod Sci, 131, 3–4, 160–4.
22. Schnieke AE, Kind JA, Ritchie AW, Mycock K, Scott RA et al., 1997, Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts, Science, 278, 2130–3.
23. Visscher AH, Dijkstra M, Lord EA, Süss R, Rösler H-J et al., 2000, Maternal and lamb carrier effects of the Booroola gene on food intake, growth and carcass quality of male lambs, Anim Sci, 71, 209–17.
24. Walker SK, Smith HD, Frensham A, Ashman JR, Seamark FR, 1989, The use of synthetic gonadotropin releasing hormone treatment in the collection of sheep embryos, Theriogenology, 31, 741–52.
25. Yadi J, Moghaddam FM, Khalajzadeh S, Solati AA, 2011, Comparasion of estrus synchronization by PGF2α, CIDR and sponge with PMSG in Kalkuhi ewes on early anestrous season. International conference on Asia agriculture and animal. IPCBEE, 13, 61–5.