Udruženje vetrinara praktičara Srbije - UVPS
Embriotransfer – tehnologija koja san pretvara u javu
Autor: Dr vet. med. spec. Miloš Trajković
Koliko sam samo puta radeći kao veterinar na terenu čuo od domaćina jednu istu rečenicu: "Ma samo da mi oteli žensko, nemam bolje u štali". Nema sumnje da je taj domaćin bar jedanput sanjao taj san – onaj momenat kada mu baš ta krava daje žensko tele – buduću kravu. On veruje da baš taj san nešto znači, o njemu ne priča nikome – "da ne baksuzira". Ali život nije san i u njemu važe pravila statistike i verovatnoće. Statistika kaže da se korišćenjem standardnog semena priplodnjaka dobija po 50 procenata potomaka muškog i ženskog pola. Korišćenjem seksiranog semena, kod kojeg su tehnološkim postupkom razdvojeni spermatozoidi muškog od ženskog pola, sa preciznošću od oko 90 posto moguće je dobiti potomstvo željenog pola. Troškovi su ovde veći zbog cene takvog semena i znatno manje uspešnosti kod krava u odnosu na junice. Statistički gledano, krave koje imaju bolju proizvodnju, u odnosu na prosek zapata u kome žive, imaju duži servis period (period od teljenja do prvog uspešnog osemenjavanja) i duži međutelidbeni interval (vreme izraženo u danima između dva teljenja) i žive kraće u odnosu na druge krave iz zapata. Sve ovo govori da takve krave, visoke proizvodnje, daju prosečno manje teladi za svoj životni vek od ostalih krava u zapatu. Za života krave, to se svodi na svega 3–4 teleta, retko više, a često i manje. Koliko će te teladi biti ženskog pola i stići do vremena kada će postati krave je pitanje koje kao odgovor ima samo jedan zaključak: zaista je teško odgajiti tri ili pet junica, od visokovredne krave, da postanu krave. A može li 20, 50 ili možda 100? MOŽE!
Embriotransfer je biotehnološka metoda kojom se dobija veći broj potomaka od jedne jedinke ženskog pola nego što je to moguće prirodnim putem. Jedinka ženskog pola, superiornih osobina, služi kao davalac (donor) jajnih ćelija ili embriona (plod star sedam dana), a ženske životinje koje su manje vredne su primaoci embriona (recipijenti).
Potrebno je da donor, kada ulazi u proces embriotransfera, bude reproduktivno zdrav, u dobroj kondiciji i sa pozitivnim energetskim bilansom.
Postoje dva načina za dobijanje embriona
In vivo metoda – Ova metoda se može izvoditi kako kod krava, tako i kod junica koje su dostigle bar 2/3 telesne mase odraslih grla. Postupak počinje 60og dana od teljenja i 9og dana od pojave estrusa (polni žar, gonjenje, vođenje, traženje). Prvo se u donora ubacuje vaginalna progesteronska spirala koja blokira ulazak donora u estrus sve do željenog momenta. Istog dana se počinje sa hormonskom stimulacijom, preparatima FSH i LH (kako bi se dobio veći broj jajnih ćelija) i to četiri dana uzastopno ujutru i uveče. Biološko poluvreme ovih hormona je svega 5 časova. Četvrtog dana ujutru se vadi vaginalna spirala i aplikuje se analog prostaglandina F2 α u cilju razlaganja žutog tela. Time se donor uvodi u estrus i osemenjava trokratno na 12 časova, isključivo standardnim (neseksiranim) semenom. Oplodnja jajnih ćelija i njihov razvoj do sedmog dana se odvijaju u donoru. Sedmog dana nakon osemenjavanja, materica se ispira i sakupljaju se embrioni. Ova tehnika se može izvoditi i na farmi ali je potrebno obezbediti stojnicu za kravu i ambijentalnu temperaturu od 20–25°C. Nakon izvođenja OPU tehnike, donoru se aplikuje analog prostaglandina F2 α, kako bi se razložila žuta tela nastala nakon ovulacija folikula. U tom momentu, jajnici krava koje su ovulirale veliki broj jajnih ćelija, izgledaju kao grozdovi i mogu biti veličine od 10 do 15 cm. Tako sakupljeni embrioni se ocenjuju po kvalitetu i odmah unose u recipijente koji takođe moraju da budu u sedmom danu nakon sinhronizovanog estrusa. Embrioni se mogu i zamrzavati za kasniji transfer. Ova metoda se može raditi na svakih šest nedelja, ali se posle dve do tri serije, krava mora osemeniti nakon prirodnog ili sinhronizovanog estrusa jer je već prošlo 6–7 meseci od teljenja. Nakon osemenjavanja, radi steonosti donora, nije moguće izvoditi ovu metodu. Jednim ispiranjem se dobija prosečno 5–6 embriona. Veći broj embriona daju tovne, u odnosu na mlečne rase. Oko 30 procenata krava neće, ili će odgovoriti vrlo slabo, na hormonsku stimulaciju. Takve krave se isključuju iz procesa embriotransfera, Polovina plotkinja će dati zadovoljavajući odgovor, a oko 20 procenata krava će dati veći broj jajnih ćelija od proseka.
Priprema i pravilan izbor recipijenta (junica ili eventualno prvotelki) može u velikoj meri da utiče na uspešnost embriotransfera. Potrebno je da plotkinje budu zdrave, u dobroj kondiciji i sa estrusnim ciklusima u pravilnim razmacima. Unošenje embriona u recipijente se izvodi u epiduralnoj anesteziji, sedmog dana nakon prirodnog ili sinhronizovanog estrusa. Embrion se unosi što je moguće dublje u rog materice i to isključivo onaj, na čijoj strani je žuto telo nastalo posle prethodnog estrusa. Uspešnost nakon unosa ovako dobijenih embriona se kreće od 50 do 60 za sveže i oko 50 procenata za zamrznute embrione. Može se računati da će prosečan donor u tri izvođenja ove procedure dati 15–18 embriona sa posledičnim rezulatom od 7–10 steonosti bez mogućnosti izbora pola teleta.
Slika 1. Izvođenje OPU metode u Centru za embriotransfer Trajkovet (neposredno uz prostoriju za OPU se nalazi embriološka laboratorija)
In vitro metoda je kod nas poznatija kao vantelesna oplodnja – IVF (engl. In Vitro Fertilisation) i može se raditi, kako kod krava, tako i kod junica starosti već od 7 meseci. Metoda se izvodi tako što se u donora unosi vaginalna progesteronska spirala koja blokira ulazak donora u estrus sve do željenog momenta. Spirala se mora menjati na svakih 14 dana. Nakon hormonske stimulacije preparatima FSH i LH, sprovodi se procedura OPU (engl. Ovum Pick Up) koja predstavlja sakupljanje jajnih ćelija vaginalnom metodom folikularne aspiracije vođene ultrazvukom. Ona ima za cilj usisavanje jajnih ćelija sa jajnika iz folikula koji su veći od 2 mm. Ova metoda se izvodi u posebnim prostorijama sa stojnicom ili u pokretnoj prikolici za izvođenje na farmi. Nakon sedacije donora i epiduralne anestezije, jednom rukom se rektalno privlači jajnik neposredno uz zid vagine, a u vaginu se drugom rukom uvodi nosač ultrazvučne sonde koji na svom vrhu ima otvor za sondu i otvor kroz koji izlazi igla povezana sa crevom vakuum pumpe. Vrh držača se postavlja uz prednji deo zida vagine sa strane, a sa druge strane zida vagine se jajnik, uz rektalnu fiksaciju, postavlja uz vrh nosača sonde i tada se na ekranu ultrazvučnog aparata uočava jajnik. Preciznom sinhronizacijom pokreta ruku, jajnik se dovodi u takav položaj da se folikul (koji se želi usisati) nađe u pravcu u kome izlazi igla. Zatim se ubada folikul i nogom se pritiska signalna papučica koja otvara ventil i pravi vakuum u crevu. Ovo dovodi do usisavanja folikulske tečnosti i jajne ćelije koje se sakupljaju u epruvetu. Nakon toga se, iz tako dobijene tečnosti, izdvajaju jajne ćelije u laboratoriji (koja može biti u sastavu prikolice) i ostavljaju u posebnom medijumu za sazrevanje. Potrebno je da jajna ćelija bude sa što više slojeva granuloznih ćelija koje je okružuju (corona radiata) jer je to neophodno u procesu oplodnje. Tako odabrane jajne ćelije se transportuju u embriološku laboratoriju.
Moguće je raditi i bez hormonske stimulacije ali se tako dobija manji broj jajnih ćelija, doduše, bez troškova vezanih za hormone.
Slika 2. Jajna ćelija sa kumulus ćelijama i spermatozoidima
Po prijemu u laboratoriju, jajne ćelije se ostavljaju na zrenje do isteka 24h od momenta sakupljanja. Nakon isteka tog vremena jajne ćelije se prebacuju u medijum za oplodnju i postavljaju u inkubator koji održava temperaturu i koncentraciju CO2 od 6 procenata. Sperma priplodnjaka (standardna ili seksirana) se obrađuje u medijumu koji ima za cilj da ubrza kretanje spermatozoida (i do 10 puta) i dodaje se zrelim jajnim ćelijama. Nakon isteka vremena od 16 časova, oplođene jajne ćelije se obrađuju kako bi se sa njih uklonile granuloza ćelije i posle nekoliko ispiranja, prebacuju u medijum za rast i u inkubator koji održava temperaturu i koncentraciju CO2 i O2 od 6 procenata. U tom medijumu, oplođene jajne ćelije ostaju do sedmog dana od oplodnje kada se vrši ocena njihovog kvaliteta. U tom momentu, embrioni se nalaze u fazi morule ili blastule i pripremaju se za unošenje u recipijente ili se zamrzavaju. Kod krava koje daju zadovoljavajući broj jajnih ćelija, može se, uz hormonsku stimulaciju, računati na 5 do 15 jajnih ćelija. Od ukupnog broja jajnih ćelija koje ulaze u postupak oplodnje dobija se 30–40 procenata embriona. Uspešnost nakon unosa ovako dobijenih embriona se kreće oko 50 za sveže i oko 45 procenata za zamrznute embrione. Prosečno se može računati da se od 10 jajnih ćelija mogu dobiti dva teleta. Ovu tehniku možemo raditi svakih 7 dana počevši od 45og dana nakon teljenja. Ukoliko se ova procedura sprovodi bez hormonske stimulacije, onda se može izvoditi na 14 dana.
Kada se želi da krava uđe u estrus, jednostavno se prekida procedura i vadi se vaginalna spirala. U roku od 10 do 15 dana, krava ulazi u estrus i može se osemeniti ili se za sedam dana nakon estrusa u nju unosi embrion. Sedam dana posle osemenjavanja može se nastaviti sa procedurom koja se obavlja iako je krava gravidna, bez bojazni da će doći do pobačaja i to sve do 90og dana graviditeta kada više nije fizički moguće privući jajnike do zida vagine za OPU tehniku. Treba napomenuti da je jednom dozom semena moguće oploditi i jajne ćelije od 10 donora, što je posebno važno za smanjenje troškova pri korišćenju seksiranog semena. Može se računati da će prosečan donor, za period od 5–6 meseci, pri intenzivnom izvođenju ove metode (oko 20 izvođenja) dati oko 200 jajnih ćelija i 35–40 teladi sa mogućnošću dobijanja potomstva željenog pola u 90 procenata.
In vitro procedura se može koristiti i kod krava koje ne mogu da ostanu steone zbog drugih reproduktivnih problema, a na njihovim jajnicima se i dalje vrši regrutacija folikula. U slučaju iznenadnog uginuća krave, mogu se, u periodu od najviše 12 časova nakon uginuća, uzeti jajnici i transportovati (u fiziološkom rastvoru na temperaturi od 30°C) do laboratorije kako bi se sa njih uzele jajne ćelije za proizvodnju embriona. Takođe se, kao izvor jajnih ćelija, mogu uzimati i jajnici sa linije klanja i oploditi spermom rasa tovnih goveda muškog pola u cilju masovne proizvodnje embriona po pristupačnoj ceni. Dobar primer za ovo su simentalske jajne ćelije × angus seksiran na muški pol. Kako klanice rade svakodnevno, laboratorija može praktično stalno imati embrione koji su spremni za embriotransfer u svežem stanju.
Slika 3. Jajne ćelije 21 čas nakon oplodnje i uklanjanja kumulus ćelija
Poznato je da u toku leta, zbog uticaja toplotnog stresa dolazi do češćeg povađanja krava kao i do težeg otkrivanja estrusa. Naime, ukoliko se u prva tri dana nakon oplodnje jajne ćelije, telesna temperatura krave poveća na preko 39,5 oC, embrion takvu sredinu registruje kao lošu za dalji razvoj i aktivira sopstvene letalne gene koji dovode do njegovog uginuća. Nakon trećeg dana, povećanje telesne temperature krava nema uticaja na razvoj embriona. Tako se zbog prevazilaženja ovog problema mogu koristiti embrioni uz sinhronizaciju estrusa recipijenta radi skraćivanja servis perioda. Ovo je posebno interesantno za farme holštajn rase koje dobijanjem tovne teladi mogu da pokriju troškove embriotransfera uz ulazak u novu laktaciju.
Slika 4. Oplođene jajne ćelije u deobi 60 časova od oplođenja
Embrioni se pre ubacivanja ili zamrzavanja obrađuju tripsinom kako bi se izbegla svaka mogućnost prenosa infektivnih agenasa Zbog toga su embrioni potpuno sigurni i za međunarodni transport.
Sve što je ovde izneto je od skoro po prvi put moguće uraditi i u Srbiji. Kompanija Trajkovet doo je otvaranjem Centra za embriotransfer u mestu Bresnica u opštini Čačak, učinila embriotransfer dostupnim i našim stočarima. U sastavu centra se nalazi i objekat za držanje donora kapaciteta 25 krava, prostorija za OPU kao i embriološka laboratorija. U sastavu Centra je i mobilna termo prikolica, opremljena stojnicom i mini laboratorijom, za izvođenje OPUa na terenu.
